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吸光度

水质检测、血糖仪、DNA 浓度测定,用的都是同一条定律:溶液越浓,吸光越强。输入摩尔吸光系数、光程与浓度,计算吸光度与透光率。

什么是吸光度?

比尔-朗伯定律计算器 - 在线计算插图

比尔-朗伯定律:A = εbc。吸光度 A 与浓度 c、光程 b 成正比,ε 是物质在特定波长下的摩尔吸光系数(它的「吸光指纹」)。透光率 T = 10^(−A),两者对数关系:A = 1 时只有 10% 光透过,A = 2 时只剩 1%。

这条定律让「看颜色深浅」变成精确定量:配制一系列标准溶液测 A,绘制标准曲线,未知样品的 A 往上一放即可读出浓度。检出限可达 10⁻⁶ mol/L 级。标准曲线在 A = 0.1–1.5 区间线性最好,超出范围要稀释或换短光程比色皿。

比尔-朗伯定律在环境监测中无处不在:大气臭氧监测(紫外吸收 254 nm)、水体浊度检测(散射吸光)、汽车尾气 NOx 分析(紫外-可见吸收)——工业化国家的每一个空气质量监测站都至少有一台基于吸收光谱原理的仪器在运转。

定律的现代延伸是多通道光谱分析:DNA 测序仪用 4 种荧光标记的吸收/发射光谱区分碱基;卫星遥感用多波段光谱反演大气成分浓度;医学脉搏血氧仪(指尖夹式)用红光 660 nm 和红外 940 nm 双波长测吸光度比,算出动脉血氧饱和度——比尔-朗伯定律已渗透到从实验室到太空的所有定量分析领域。

A = ε × b × c;T = 10^(−A) × 100%;c = A ÷ (ε × b)

ε = 11000,b = 1 cm,c = 5×10⁻⁵ mol/L → A = 11000 × 1 × 5×10⁻⁵ = 0.55,T = 10^(−0.55) = 28.2%

常见物质的摩尔吸光系数与最佳测定波长
物质波长 (nm)ε (L/(mol·cm))检出限 (mol/L)
邻菲罗啉-铁配合物510110002×10⁻⁶
高锰酸钾 (KMnO₄)52524254×10⁻⁵
双硫腙-汞配合物485710003×10⁻⁸
DNA (A260)260—(50 μg/mL)1×10⁻⁶
蛋白质 (BCA法)562—(线性)20 μg/mL
亚硝酸盐 (Griess法)540450005×10⁻⁷
叶绿素 a663840001×10⁻⁷

如何使用吸光度

  1. 1

    输入摩尔吸光系数 ε(L/(mol·cm),查文献或由标准曲线获得)。

  2. 2

    输入比色皿光程 b(cm,标准比色皿 1 cm)。

  3. 3

    输入浓度 c(mol/L),点击「计算」查看吸光度与透光率。

计算示例

例 1铁离子显色测定

邻菲罗啉-铁配合物在 510nm 的 ε ≈ 11000:1 cm 比色皿、浓度 5×10⁻⁵ mol/L,A = 11000 × 1 × 5×10⁻⁵ = 0.55——正好落在最佳测量区间,透光率 28.2%。

例 2核酸浓度检测

DNA 在 260nm 的换算系数为 50:测得 A260 = 0.4(1 cm 光程),浓度 = 0.4 × 50 = 20 μg/mL。实验室每天上演的换算,本质就是比尔-朗伯定律。

注意事项

  • 定律要求单色光、稀溶液(一般 <0.01 mol/L),浓度过高会因分子间作用偏离线性。

  • ε 随波长变化:必须说明测量波长,通常选最大吸收峰处以提高灵敏度。

  • 浊度与气泡会让光散射,虚增吸光度——样品必须澄清。

  • 荧光、化学变色等干扰会让表观 A 失真,空白对照必不可少。

常见问题

溶剂与比色皿本身也吸收少量光,空白(不含待测物的溶剂)测得的 A 是背景。仪器将其扣除后,读数才是溶质的真实吸光度——否则低浓度样品误差可达 50%。

透光率不足 1%,检测器噪声占比急剧上升,读数不可靠。解决办法:稀释样品、换 0.1 cm 短光程皿、或改测吸收较弱的次峰波长。

朗伯(1760)发现吸光与光程成正比;比尔(1852)发现吸光与浓度成正比。两条规律合并成今天的比尔-朗伯定律——科学史上「联名」定律的经典案例。

A < 0.1 时透光率 > 79%,信号与空白差异太小,噪声占比大;A > 1.5 时透光率 < 3%,检测器需极高增益,暗电流和杂散光非线性增大。0.1–1.5 区间信噪比最优、仪器线性响应最可靠。

杂散光(非单色光)不经样品直接到达检测器,等效于「假透光」。A = 2 时真实透光 1%,若杂散光占 0.5% 则表观 T = 1.5%,A 被低估为 1.82——偏离 9%。所以高端分光光度计会标明杂散光指标(< 0.0001%)。

分光光度法测溶液中分子/离子的紫外-可见吸收(连续光源 + 单色器);原子吸收光谱测元素的共振线吸收(空心阴极灯锐线光源),专测金属元素原子化后的吸收。两者都基于比尔-朗伯定律,但光源和样品形态不同。

DNA/RNA 的碱基(嘌呤/嘧啶)在 260 nm 有最大吸收峰;蛋白质的芳香氨基酸(Trp/Tyr)在 280 nm 吸收。A260/A280 比值用于评估核酸纯度:纯 DNA 比值 ≈ 1.8,纯 RNA ≈ 2.0,比值偏低表示蛋白质污染。

不能直接用。浊度(悬浮颗粒散射光)不服从 A = εbc 的线性关系,需用浊度计(测散射光角度强度)或比浊法(近似处理)。但极低浊度时悬浮液可近似用比尔-朗伯定律估算浓度——这就是免疫比浊法测定蛋白浓度的原理。

分光光度计用单光束/双光束通过一个比色皿测量;酶标仪(microplate reader)用光学系统同时读取 96 孔板/384 孔板的每孔吸光度——通量高 100 倍,适合药物筛选和 ELISA。两者核心原理相同,但光学路径和自动化程度不同。

卫星携带光谱仪测大气对太阳光的吸收,不同波段的吸光度反演气体柱浓度:紫外波段测臭氧、红外测 CO₂/CH₄、可见波段测气溶胶。这是全球温室气体监测网(GOSAT/OCO-2)的核心原理——从太空给地球「抽血化验」。

参考资料

  1. [1]OpenStax · Chemistry 2e · Spectroscopy
  2. [2]NIST · UV/Vis Spectral Database (WebBook)
  3. [3]NASA OCO-2 Mission · Atmospheric CO₂ Retrieval
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凯文内容作者Calcton 化学编辑组 口径审核Calcton 编辑组 交叉审核· 内容更新于 2026-05-05

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引用本页

GB/T 7714 格式

Calcton. 吸光度[EB/OL]. https://www.calcton.com/beer-lambert, 2026-05-05.

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最后更新:2026-05-05。

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